細胞壁局在性のインベルターゼ欠損出芽酵母であるＳＥＹ６２１０（ＭＡＴα Ｌｅｕー３１１２ ｕｒａ３ー５２ ｈｉｓ３Δ２００ ｔｒｐ１ーΔ９０１ ｌｙｓ２ーΔ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、８０１ ｓｕｃ２ーΔ９ １９８８）に大腸菌と酵母のシャトルベクターであるＹＥｐＳＵＣ０２（７１３３ｂｐ）の持つアンピリシリン耐性遺伝子とインベルターゼ遺伝子とＳＵＣ３遺伝子に加えて、光る為の装置として以下の条件で工夫を加えた。
- オワンクラゲの遺伝子であるeGFPを含むベクターを鋳型として、Upper primerとLower primerを用い、PCRにて７３４ｂｐのeGFPコーディング配列を増幅する。
- ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、eGFPを含むＤＮＡ断片を回収する。
- 制限酵素BglⅡにて切断
- アガロースゲル電気泳動にてeGFPを含む断片を回収する。
- 酵母ＹＥｐＳＵＣ０２plasmidを制限酵素BglⅡにて切断。
- アガロースゲル電気泳動にて生成物を回収する。
- ５）で切断した酵母ＹＥｐＳＵＣ０２plasmidを４）で切断したeGFPを含む断片 とをライゲーションする。（必要があればＹＥｐＳＵＣ０２plasmidはフォスファターゼ処理しておく）
- 大腸菌（JM１０９）に形質転換する。すなわち、アンピシリン耐性のコロニーを得る。
- コロニーからのDNAの抽出と制限酵素によるコンストラクトの確認
コロニーからplasmid DNAを抽出し、制限酵素NcoⅠ切断し、断片サイズを測ることによって確認する。SUC２プロモーターの制御下で、SUC２のコードするインベルターゼにeGFPが融合したたんぱく質を発現する。
- 酵母（ＳＥＹ６２１０）に形質転換
酵母への形質転換は、ＹＥｐＳＵＣ０２plasmidに載っているURA３マーカーによってウラシル要求性でコロニーの選抜を行う。ＹＥｐＳＵＣ０２は、大腸菌のレプリコンと酵母のレプリコン（２μ）を同時に持つ、シャトルベクターである。
- SUC２のプロモーターは、高濃度（１０％）のグルコースで発現が抑制され、０％グルコースに培地を替える。これによってSUC2：eGFP融合たんぱく質が合成されるようになる。SUC2にコードされるインベルターゼは細胞質ではなく細胞壁に９９％留まるためSUC2：eGFP融合たんぱく質も細胞壁に高い割合で留まることが期待される。このため、肉眼でも紫外線を照射すると緑色蛍光を観察することができるものと期待される。
SEY６２１０株はSUC2遺伝子が破壊されており、グルコースによるSUC2の抑制が強くかかることが期待される。
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